ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行，有的同行可能會(huì)認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進(jìn)行，那么此時(shí)便可以萬事大吉了，其實(shí)不然，因?yàn)楫?dāng)代較為先進(jìn)的酶標(biāo)儀器儀表，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會(huì)得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測定后，有許多陰性測定孔的吸光度值為負(fù)數(shù)或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。至于如何正確理解和使用酶標(biāo)儀詳見后面有關(guān)章節(jié)。此處，重點(diǎn)關(guān)注點(diǎn)下面兩點(diǎn)：
1、比色測定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測定時(shí)，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。
2、單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時(shí)具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而雙波長雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長比色時(shí)，仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)造成前面提到的測定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時(shí)，最好是使用雙波長比色。