在定量PCR（也稱rt-PCR或qPCR）中，熒光信號是由熒光探針或熒光DNA結合染料（如SYBR Green）產生，其強度與PCR產物分子（擴增子）的數量成正比。每個循環結束時，收集熒光信號強度，通過將熒光強度與循環數作圖，qPCR儀生成擴增曲線，其表示在整個PCR過程中產物的累積，通過這個過程，即可實現量化。如果樣品中特定的序列（DNA或RNA）豐富，則在較早的循環中觀察到擴增，Ct值小;如果序列稀少，則在稍后的循環中觀察到擴增，Ct值大。此SOP將涵蓋總RNA提取和兩步法逆轉錄定量PCR（qRT PCR）的操作過程以及數據分析。

注意事項:

1、 所有步驟均應在超凈工作臺上進行，超凈臺紫外照射至少15min。

2、所有試劑應為此實驗專用。

3、使用75％乙醇或其他去污劑擦拭工作臺，避免表面污染。

4、 進入熒光定量PCR 操作實驗室后需要佩戴一次性無菌口罩、無菌乳膠手套、實驗中盡量避免與同事交談，防止PCR 模板污染。

5、實驗中使用各種規格的離心管，槍頭及配制試劑和溶解沉淀用的水，均應焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。

6、 使用Trizol試劑時，避免接觸皮膚或衣服。避免吸入蒸氣。

7、qPCR反應需要qPCR級水，試劑和試管。請務必使用正確類型的qPCR光學PCR管和蓋子。不可用普通的PCR管。

8、加樣前，先布局，規劃加樣順序以避免交叉污染。

9、所有實驗應均應設置無模板對照，其中包含除DNA或cDNA樣品以外的所有反應組分。

10、先配制qPCR反應混合液，減少誤差。

11、 加樣后上機前，務必通過瞬離將反應液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因為氣泡會干擾熒光檢測且降低酶活性，從而降低擴增效率。