夾心ELISA測定兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間的抗原。目標抗原必須包含至少兩個能夠結合到抗體的抗原表位。單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進行定量檢測。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。

    夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）。

 夾心 ELISA 程序可能難以優化，應使用已測試的匹配抗體對。這樣可確保抗體檢測靶蛋白上的不同表位，而不會干擾其它抗體結合。我們不能保證我們的抗體可用于夾心 ELISA，除非它們已經過專門的測試。

雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，操作過程如下： 

1、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

2、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

3、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

4、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。