顯色是ELISA檢測試劑盒中的后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色狀況適當縮短或延長反應時間及時判斷。
 

　　ELISA檢測試劑盒實驗中顯色十分重要，當ELISA沒有顯色，可能原因有這幾個方面：
 

　　1.包被原：包括你的包被液有無問題，有沒有配錯。包被原一般加100微升，37度2小時；
 

　　2.封閉：封閉液用的是否適合？你說做了幾次都沒顯色，空白孔也不顯嗎？如果空白也無顏  色，那封閉就沒有問題。一般封閉是200微升每孔，也可以滿孔封閉
 

　　3.一抗：檢查你的一抗是否失效。是否是在37度反應
 

　　4.二抗：底物，底物緩沖液……這些都要好好檢查！
 

　　5.洗滌：用PBST洗滌，包被和封閉時洗板3次；一抗二抗洗滌5次，每次間隔3分鐘。手工和機器洗滌沒什么不同，就是省力一些。洗5次不會有負影響，在一抗和二抗洗滌過程中，恰恰需要多洗幾次，這樣有助于減少非特異性吸附。
 

　　避免顯色淡靈敏度低，需注意以下幾點：
 

　　1、 常規ELISA試劑盒平衡至30min；
 

　　2、 檢測抗體、偶聯HRP請按說明書稀釋比；
 

　　3、 樣本、抗體孵育條件(溫度、轉速)，請根據說明書；
 

　　4、 控制TMB底物顯色時間。