川牛膝探針法PCR鑒定試劑盒說明書

儲存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據地黃保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

使用方法：
一、樣品采集：
1、食品樣品：樣品的采集與預培養按照樣品的采集與預培養按照《食品衛生微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗要求進行。
2、血液樣品：用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
3、糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品：取發病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
注：上述樣品建議經過增菌后，收集培養物用于檢測。 
二、DNA提取：
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購上海澤葉生物科技有限公司生產的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
1、液體培養物：取液體培養物100μL加到1.5mL無菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
2、固體培養物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
3、糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
4、其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議在樣品制備區域加入陽性對照。 
SELE Others Human 人 E-Selectin / CD62E 人細胞裂解液 (陽性對照) Methocarbamol質量規格：>98.5%,USP 32

人羊膜細胞;WISH（標準品）Methocarbamol質量規格：HPLC>98%,標準品

CD3D Others Mouse 小鼠 CD3d / CD3 delta 人細胞裂解液 (陽性對照) 甲基潑尼龍Methylprednisolone質量規格：>97%,BR,可用于細胞培養

人尿道上皮細胞*培養基 100mL甲基潑尼龍（標準品）Methylprednisolone質量規格：HPLC>97.5%,標準品

Neuro-2a細胞，小鼠腦神經瘤細胞 MDA-MB-231(癌細胞) 人腦瘤細胞;SF767（慢心率）Mexiletine 質量規格：>98%,BR
EB病毒轉化的人B細胞;KM9401 人血管內皮細胞*培養基 100mLN-(2-丁二酰)氟伏沙明N-(2-Succinyl) Fluvoxamine質量規格：美國進口

非必需氨基酸　100XNEAA福辛普利Fosipril質量規格：美國進口

MAP2K4 Others Mouse 小鼠 MKK4 / MEK4 / MAP2K4 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) (R)-鹽酸氮卓斯汀(R)-Azelastine 質量規格：美國進口

人小細胞肺癌細胞;NCI-H4469-去氧-9a-氮雜-同型A 去甲9-Deoxo-9a-aza-9a-homo Erythromycin A Desmethyl Azithromycin質量規格：美國進口

L6565細胞，小鼠L6565白血病克隆細胞系 人胃癌細胞,MKN-28細胞 猴源細胞Azithromycin質量規格：美國進口
IL17RA Others Rat 大鼠 IL17RA / IL17R 人細胞裂解液 (陽性對照) 耐斯糖（標準品）質量規格：含量測定NISTOSE

原代腎實質細胞特制無血清添加劑Many types of cells包裝：1ml對羥基苯乙酮（標準品）質量規格：供含量測定用4'-Hydroxyacetophene

OS-732細胞，骨肉瘤細胞(瘤株) 人細胞,SiHa細胞 人脊髓星形膠質細胞總RNAHA-sp NA3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇（標準品）質量規格：含量測定3,29-Dibenzoyl rarounitriol

非洲綠猴腎細胞系/IgR;VERO/IgR牛磺（標準品）質量規格：含量測定TAUROHYODEOXYCHOLIC ACID  SALT

FZD5 Others Human 人 Frizzled-5 人細胞裂解液 (陽性對照) 苦玄參苷X（標準品）質量規格：HPLC≥97%,標準品Picfeltarraenin X
川牛膝探針法PCR鑒定試劑盒說明書CRT細胞，神經膠質瘤細胞 曲霉 人海馬趾星形膠質細胞RNAHA-h miRNA5 μg2-Octal2-辛醇25克AR，97%

RTE(大鼠氣管上皮細胞) 5×106cells/瓶×21,12-十八烷二醇 1,12-OCTcDqCcNqDIOL 76-73-0

HBL-100(人整合SV40基因的上皮細胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0361HPAC(人胰腺腺泡上皮癌)5×106cells/瓶×2 水牛皮膚成纖維樣細胞;WB-S2肖醋錳50%溶液 Mcngcus nitnctq hqxchyd
實驗流程：
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀器 、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。

3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
7. 儀器 擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。